肥胖是非酒精性脂肪肝（NAFLD）最重要的病因，随着肥胖症的全球大流行，NAFLD的发病率也随之快速升高，现在已经成为最主要的慢性肝脏疾病。如果不加干预，NAFLD将可能进展至肝脏纤维化，甚至慢性肝病的最终阶段：肝硬化[1]。长期肝硬化将可能导致患者罹患肝细胞癌（HCC），因此NAFLD也是HCC的危险因素之一。
HCC患者如能在早期阶段能得到诊断，则可以极大的延长患者的生存时间，因此指南推荐肝硬化的患者每半年做一次肝癌相关筛查[2]。病毒性肝炎也可能导致患者罹患HCC，该类患者通常会遵循医嘱定期通过肝脏超声体检。
但NAFLD和病毒性肝炎不同，它的患者人群规模更大，HCC发病率则低得多，在NAFLD肝硬化患者中，HCC的发病率仅0.1%-0.6%。对如此大规模的人群，通过常规方法筛查HCC的效费比会非常低[3]。因此，对NAFLD人群进行肝癌风险的预测研究，找出HCC高风险人群，就可以减少筛查人数规模，提高检测效能。
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近期，美国德克萨斯大学西南医学中心内科消化与肝病科Yujin Hoshida教授团队，通过前瞻性的标本收集，回顾性的盲态分析及生物标志物验证，确定了NAFLD患者HCC特异性风险分子标签。研究结果发表于Science Translational Medicine杂志[4]。
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该研究纳入了多个NAFLD患者队列，患者来自全球各个地区，共409人。研究者通过分析患者肝脏活检组织和血液转录组和血清分泌组数据，成功构建并验证了非酒精性脂肪肝肝癌风险分子标签：PLS-NAFLD和PLSec-NAFLD。
该分子标签可以有效预测NAFLD患者罹患HCC的风险，独立验证分析发现，在无HCC病史的NAFLD的人群中，PLS-NAFLD高危的患者15年时间内HCC发病率分别为22.7%，而低危患者仅为0%；在既往有HCC病史（已切除）的NAFLD患者中，高低风险患者的5年时HCC复发率分别为71.8%和42.9%。
通过生物信息学将PLS-NAFLD转化为4蛋白分泌组分子标签，即更加便于临床应用的PLSec-NAFLD，验证分析发现PLSec-NAFLD高/低风险的患者，15年时HCC发病率分别为37.6%和0%，表现出良好的预测效果。
接下来咱们就一起来看看这个研究是如何开展的。
该研究纳入了4个独立的队列，大体上可以分为从未患有HCC的NAFLD的患者、以及既往患有HCC但已根治性消融/完全切除的NAFLD的患者。之所以纳入既往患有HCC但已根治性治疗的患者，是因为研究基于两个重要的假设：1、既往患有HCC但已根治性治疗的患者，其肝脏已经成为多中心癌变和异时性HCC复发的土壤，HCC复发的风险与未患HCC的患者相比高出约3倍；2、这类患者很有可能出现全新的，不同于原肝癌的肝癌复发。
首先，研究者在包含有既往患有HCC但已根治性消融的NAFLD队列，即所谓的源队列中，定义了一个由133个基因组成的可预测HCC风险的基因标签PLS-NAFLD。该基因标签可以将源队列分为高风险（19人，40%）、中风险（9人，18%），低风险（20人，42%）三个组别。
但分析发现，高风险和中风险组的HCC风险相似，而低风险组患者HCC风险显著低于高/中风险组（低风险HCC年发病率为7.2%，高/中风险组为60.4%）。据此，研究者最终决定将源队列分成高、低风险两组。该基因标签独立于任何临床、组织学、NAFLD相关基因特征数据，也独立于纤维化等级以及单核苷酸多态性（SNP）数据。
分子通路分析发现，PLS-NAFLD高风险与T细胞介导的免疫反应，B细胞激活，巨噬细胞迁移，以及T细胞耗竭相关。高风险PLS-NAFLD还和肿瘤坏死因子通路，自噬通路，YAP相关蛋白信号通路，突发心动过速相关，原先有报道显示这些信号通路与NAFLD驱动的疾病进展及肝癌的发生相关；相比之下，高风险PLS-NAFLD人群中，维持正常肝功能的体内平衡调节因子的表达显著下调。
然后，研究者通过外部数据对该基因标签进行了第一次验证。该外部数据集为106名经组织活检确认为NAFLD患者，但这些患者均无HCC病史。根据肝脏活检的组织转录组数据，研究者计算出PLS-NAFLD，将该人群分为71（67%）名高风险人群和35（33%）名低风险人群。
在中位时间为8.9年的随访中，高风险组中6名受试者发生HCC，每年的发病率为0.9%（每年），而低危人群中，无受试者发生肝癌，两组的15年累计肝癌发病可能性则分别为22.7%和0，因此PLS-NAFLD高危险NAFLD患者相比于低风险患者，HCC的发病风险显著升高。
经验表明，相比于单次检测，持续多次监测甲胎蛋白，能更有效的预测HCC风险。受此启发，研究者在PLS-NAFLD高风险的NAFLD患者（59名），间隔2.3年后（中位时间），再次行肝脏活检，计算PLS-NAFLD综合得分。
数据显示，27（47%）名患者再次活检后，患HCC的风险降低，22（38%）名患者风险不变，9（16%）名患者风险升高。后续研究观察到，患HCC的患者均来自于风险无降低组，前后两次风险的改变和未来HCC发病的风险显著相关。
研究者进一步在特殊NAFLD人群中验证PLS-NAFLD风险模型，该NAFLD人群前期诊断有HCC，但已经完整手术切除。该队列中发现，患者属于PLS-NAFLD高风险，和HCC复发显著相关。
但PLS-NAFLD需要有创性的肝脏活检，大规模应用显然会受到限制。研究者使用前期发展出的计算管线，将基于活检组织转录组数据的的PLS-NAFLD转化为基于血液4蛋白外泌体的PLSec-NAFLD。PLSec-NAFLD包含两个高风险相关蛋白（lymphotactin和progranulin）和两个低风险相关蛋白（angiopoietin 2和hepatocyte growth factor receptor）。
随后，研究者在外部数据中成功验证了PLSec-NAFLD模型：和PLS-NAFLD相似，PLSec-NAFLD和目前已知的HCC临床风险因素无关，高风险、低风险患者患病率（每年）分别为2.7%，0%，15年HCC的患病可能性为37.6%和0%；PLSec-NAFLD评分与高风险患者HCC的发病率显著相关。
研究者还在减肥手术[5]、他汀类降脂药[6]以及IDO抑制剂相关临床前研究和临床相关研究中发现，PLS-NAFLD可以作为NAFLD患者发展为HCC的长期风险生物标志物。
最后研究者认为，虽然该研究展示出PLS-NAFLD具有可观的HCC预测能力，但是研究本身也存在一些局限性，比如研究队列的人数相对较少，健康人群中HCC的患病人数较少，各个队列之间的人群背景存在差异，以及回顾性研究可靠性较低，因此对结果的解读仍需谨慎，应开展前瞻性研究来进一步验证。
总之，该研究开发并验证了基于组织转录组和血清分泌组的分子标签PLS/PLSec-NAFLD，可以有效预测罹患HCC长期风险，以及该分子标签用于评估治疗干预对NAFLD患者罹患HCC的影响。研究者认为，这套分子标签可用于帮助改善NAFLD相关HCC的不良预后。
参考文献
1. Loomba R, Friedman SL, Shulman GI. Mechanisms and disease consequences of nonalcoholic fatty liver disease. Cell. 2021 May 13;184(10):2537-2564.
2. Marrero JA, Kulik LM, Sirlin CB, et al, Staging, and Management of Hepatocellular Carcinoma: 2018 Practice Guidance by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 2018 Aug;68(2):723-750.
3. Sanyal AJ, Van Natta ML, Clark J, et al; NASH Clinical Research Network (CRN). Prospective Study of Outcomes in Adults with Nonalcoholic Fatty Liver Disease. N Engl J Med. 2021 Oct 21;385(17):1559-1569.
4. Fujiwara N, Kubota N, Crouchet E, et al. Molecular signatures of long-term hepatocellular carcinoma risk in nonalcoholic fatty liver disease. Sci Transl Med. 2022 Jun 22;14(650):eabo4474. doi: 10.1126/scitranslmed.abo4474.
5. Rustgi VK, Li Y, Gupta K, et al. Bariatric Surgery Reduces Cancer Risk in Adults With Nonalcoholic Fatty Liver Disease and Severe Obesity. Gastroenterology. 2021 Jul;161(1):171-184.e10.
6. D. Margerie, P. Lefebvre, V. Raverdy, U. Schwahn, et al. Hepatic transcriptomic signatures of statin treatment are associated with impaired glucose homeostasis in severely obese patients. BMC Med. Genomics 12, 80 (2019).
